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阿爾茨海默?。ˋD）是最主要的神經(jīng)退行性疾病，Aβ（特別是Aβ42）是導(dǎo)致AD的重要成因。γ-secretase在Aβ的生成過程中發(fā)揮著重要作用，因此一直被人們視作抗AD藥物研發(fā)的一個重要靶點。然而，分子量高達(dá)230kDa、多次跨膜且高度糖基化的γ-secretase給傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)解析方法提出了重大挑戰(zhàn)。近些年，施一公團(tuán)隊?wèi)?yīng)用Cryo-EM SPA技術(shù)以3.4 ?分辨率解析γ-secretase的結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步解析了4種靶向藥物與γ-secretase結(jié)合形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，為新一代藥物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化提供了重要啟示。
- 01 -
γ-secretase是抗AD藥物研發(fā)的重要靶點
阿爾茨海默?。?/span>Alzheimer’s Disease, AD）是全球最主要的神經(jīng)退行性疾病，患病人群的規(guī)模龐大。淀粉樣斑塊沉積是AD的兩大病理特征之一，這些斑塊主要由β-淀粉樣小肽（β-amyloid, Aβ）沉積形成。自1991年發(fā)現(xiàn)淀粉樣前體蛋白（Amyloid Precursor Protein, APP）突變參與家族性AD（FAD）發(fā)病以來，淀粉樣蛋白級聯(lián)假說就逐漸成為AD發(fā)病機理的主流理論，而早老素1（Presenilin 1, PS1）突變體的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了這一假說[1]。
Aβ是APP經(jīng)由淀粉樣生成途徑被分泌酶切割產(chǎn)生的片段。在該途徑中，APP的N端在質(zhì)膜的胞外側(cè)首先被β-分泌酶（β-secretase）切割，然后其C端的99個氨基酸殘基（C99）會進(jìn)一步被γ-分泌酶（γ-secretase）切割，產(chǎn)生胞內(nèi)域和一個包含48或49個殘基的跨膜區(qū)短肽（Aβ48或Aβ49）。Aβ48和Aβ49可繼續(xù)被γ-secretase以消化3或4個殘基的方式切割。其中Aβ49被切割后產(chǎn)生Aβ46，Aβ43和Aβ40。而Aβ48被切割后產(chǎn)生Aβ45，Aβ42和Aβ38[2]。人體中Aβ存在的最主要形式是Aβ40和Aβ42。由于這些Aβ片段幾乎包含了APP這一單次跨膜蛋白的整個跨膜區(qū)段而具有很強的疏水性，所以極易聚集并在體內(nèi)形成淀粉樣纖維，進(jìn)而沉積形成淀粉樣斑塊。其中，Aβ42和Aβ43最容易聚集并產(chǎn)生神經(jīng)毒性，從而引起AD[3]。
圖1. Aβ單體主要在神經(jīng)元內(nèi)體中產(chǎn)生并外排至細(xì)胞間質(zhì)中逐步聚集(Justin M. Long and David M. Holtzman1, 2019)
人源γ-secretase由Presenilin, Aph-1, Pen-2和Nicastrin共4個亞基組成，其中Presenilin構(gòu)成了執(zhí)行酶活性的功能亞基，它具有PS1和PS2兩個同源異構(gòu)體。目前在PS1, PS2和APP上鑒定出200多個突變與AD相關(guān)，絕大部分都集中在PS1上[4]。這些突變中的大部分突變導(dǎo)致APP不正常切割，致使生成Aβ變多或者Aβ42/Aβ40的比率升高[5]。這些發(fā)現(xiàn)表明Aβ（特別是Aβ42）是導(dǎo)致AD的重要成因。在這個假設(shè)前提下，如能夠抑制或者調(diào)節(jié)γ-secretase的切割活性，或許能夠減少Aβ的產(chǎn)生，達(dá)到治療AD的目的[6]。因此理解γ-secretase的分子機理以及藥物對γ-secretase的作用機制極為關(guān)鍵。
- 02 -
冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)解決γ-secretase結(jié)構(gòu)解析重大難題同其他多次跨膜膜蛋白一樣，科學(xué)家們在很長時間內(nèi)都無法得到生長良好的γ-secretase蛋白晶體，因此很難通過X-Ray衍射這一傳統(tǒng)技術(shù)獲得γ-secretase的高分辨率結(jié)構(gòu)。同時，面對分子質(zhì)量高達(dá)230kDa，具4個亞基且高度糖基化的成熟γ-secretase，NMR分析也同樣力不從心。2013年程亦凡教授與David Julius博士合作，率先應(yīng)用冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)（Cryo-EM Single Particle Analysis, Cryo-EM SPA）解析了TRPV1蛋白結(jié)構(gòu)[7]，并將其分辨率提升到近原子級別的3.4 ?，為Cryo-EM在結(jié)構(gòu)領(lǐng)域的應(yīng)用帶來了重大突破。同時也讓人們意識到，Cryo-EM很可能成為解決高分子量多次跨膜蛋白結(jié)構(gòu)解析難題的新一代技術(shù)。
2015年，施一公團(tuán)隊率先在Nature上發(fā)表文章，報告了應(yīng)用Cryo-EM SPA技術(shù)解析的γ-secretase近原子級蛋白結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到?3.4 ?[8]。在2018-2019年，施一公團(tuán)隊又先后在Nature和Science上發(fā)表文章，利用冷凍電鏡解析了人源γ-secretase識別并結(jié)合Notch和APP的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，關(guān)鍵區(qū)域分辨率分別達(dá)到2.7 ?和2.6 ?[9,10]。
圖2.?人源γ-secretase近原子級結(jié)構(gòu)?(Bai.X.-C., et al. 2015)
- 03?-
冷凍電鏡高效解析候選藥物與γ-secretase復(fù)合物結(jié)構(gòu)，領(lǐng)航新一代藥物研發(fā)
γ-分泌酶抑制劑（GSI）和調(diào)節(jié)劑（GSM）的開發(fā)為AD提供了富有前景的治療機會。但這些GSI和GSM如何靶向γ-secretase仍然未知。2021年施一公團(tuán)隊在Cell上發(fā)表新文章，再次應(yīng)用Cryo-EM SPA解析了4種候選分子與γ-secretase復(fù)合物結(jié)構(gòu)[11]。文章報告γ-secretase分別與3種GSI（Semagacestat, Avagacestat和過渡狀態(tài)類似物L458）或1種GSM（E2012）結(jié)合復(fù)合物結(jié)構(gòu)，分辨率2.6–3.1?，均達(dá)到近原子級別。值得注意的是，每個GSI在PS1上均占據(jù)底物位置，從而干擾底物的募集。而E2012可與γ-secretase別構(gòu)位點結(jié)合，這可能解釋了其調(diào)節(jié)活性。這些基于冷凍電鏡的結(jié)構(gòu)解析工作，有望指導(dǎo)基于藥物構(gòu)效關(guān)系（Structure Activity Relationship, SAR）的下一代靶向γ-secretase藥物的開發(fā)。
本研究首先在體外驗證了課題組純化的重組γ-secretase的活性，并使用Alpha Lisa Assay測量不同條件重組γ-secretase切割C99生成Aβ40的活性，用于評估3種GSI靶向Aβ生成的抑制作用。之后解析γ-secretase分別結(jié)合Semagacestat, Avagacestat，L458和E2012后形成的復(fù)合物電鏡結(jié)構(gòu)。Semagacestat由Eli Lily開發(fā)，是第一個進(jìn)入III期臨床評估的GSI[12]。與令人鼓舞的早期結(jié)果相反[13]，Semagacestat未顯示預(yù)期的認(rèn)知改善，卻產(chǎn)生嚴(yán)重副作用[14]，這歸因于Semagacestat抑制了γ-secretase對Notch等其他重要底物的水解[15]。
圖3.?人源γ-secretase結(jié)合Semagacestat的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?(原文圖2)
結(jié)構(gòu)解析結(jié)果顯示：Semagacestat的結(jié)合位點與APP-C99或Notch-100的β-鏈完全相同，位于PS1胞內(nèi)側(cè)的深腔中（圖3, A）。該發(fā)現(xiàn)為Semagacestat抑制γ-secretase的活性提供了直接且令人滿意的解釋。Semagacestat占據(jù)該位點可能阻礙PS1和底物間雜化β-片層形成，從而抑制γ-secretase水解底物。Semagacestat與PS1的K380和L432的主鏈形成4個氫鍵（圖3, D左），這兩個殘基在γ-secretase識別C99或Notch -100時同樣發(fā)揮重要作用[9,10]，提示Semagacestat與PS1結(jié)合模式與PS1的天然底物相似。此外，Semagacestat上芳香環(huán)和甲基還與PS1疏水殘基的側(cè)鏈接觸并形成生范德華力，但仍然留下了幾個小縫隙（圖3）。若在這些縫隙中填充其他疏水基團(tuán)，以填充Semagacestat與V261或V272周圍的疏水空間，可能提高新一代抑制分子的特異性和抑制能力。
為了解決Semagacestat底物選擇性差、毒副作用顯著的問題，Avagacestat作為具有底物選擇性的GSI而被開發(fā)。相比于Semagacestat，Avagacestat選擇性抑制PS1對C99的水解，作用比底物為Notch時強約3-193倍[16]。盡管如此，高劑量的Avagacestat仍然會抑制PS1對Notch的水解并顯示毒性。Avagacestat的結(jié)合模式如何賦予其底物選擇性是個非常有價值的研究問題。復(fù)合物的結(jié)構(gòu)顯示，雖然Avagacestat與Semagacestat的化學(xué)性質(zhì)完全不同，但Avagacestat與Semagacestat結(jié)合位點完全相同（圖4, B）。因此Avagacestat同樣占據(jù)PS1底物結(jié)合位點，阻止雜化β-片層的形成從而抑制γ-secretase的活性。
圖4.?人源γ-secretase結(jié)合Avagacestat的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?(原文圖3)
但Avagacestat的具體結(jié)合模式與Semagacestat存在很大的區(qū)別，這可能是其抑制作用底物選擇性的原因。Avagacestat主要與PS1疏水殘基互作，只與G382主鏈酰胺基形成1個氫鍵（圖4, C）。Avagacestat三氟戊酰胺基（圖4, A中Thumb區(qū)）位于PS1 N端（NTF）V261，L268和V272構(gòu)成的疏水口袋（圖4, C左）。Avagacestat氯苯基（圖4, A中Index區(qū)）結(jié)合在PS1 C端（CTF）與L418，T421，L425和A434間形成范德華力（圖4, C右）。Avagacestat惡二唑氟芐基（圖4, A中Stem區(qū)）一側(cè)與PS1結(jié)合（圖3D，左），另一側(cè)在空間上相對裸露，因此可用于進(jìn)一步修飾（圖3D，右中綠色圈），以增強抑制強度和特異性。
與Semagacestat和Avagacestat不同，L458是一種競爭性過渡態(tài)類似物抑制劑（TSA）。L458直接結(jié)合PS1活性位點，在空間上大致與Semagacestat和Avagacestat相同（圖5, B）。?L458和位于催化中心的2個天冬氨酸（D257, D385）同時形成氫鍵，并與與PS1上的其他氨基酸形成另外的5個氫鍵（圖5, C），還能同周圍的疏水殘基形成范德華力（圖5, D）。相較于非TSA抑制劑，L458可以與PS1催化位點上方的口袋進(jìn)一步結(jié)合，以加固抑制劑與催化殘基D257和D385之間的氫鍵。
圖5.?人源γ-secretase結(jié)合L458的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?(原文圖5)除GSI以外，GSM也被公認(rèn)為是一類有吸引力的小分子。GSM很可能會促進(jìn)Aβ42的進(jìn)一步切割，從而減少易于聚集的Aβ的產(chǎn)量[17]。與GSI不同，GSM在遠(yuǎn)離活性位點的別構(gòu)位點處識別并結(jié)合γ-secretase。這提示我們，特定GSI可與GSM配合使用并發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)而實現(xiàn)底物選擇性抑制。2013年，Pozdnyakov等曾報道L458可以增強E2012與γ-secretase的結(jié)合力[17]。
體外孵育實驗表明，單獨使用5 nM的?L458或50 mM GSM E2012時僅導(dǎo)致γ-secretase水解C99活性的溫和抑制，而二者聯(lián)用卻能幾乎完全抑制水解（圖6, A）。為闡釋L458與E2012對γ-secretase活性調(diào)節(jié)的協(xié)同作用，團(tuán)隊以2.6?的分辨率獲得了同時與E2012和L458結(jié)合的重組人源γ-secretase的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。E2012插入PS1和NCT界面處的疏水口袋中，并與PS1的loop-1互作（圖6, C），覆蓋部分底物結(jié)合通道（圖6, D），從而調(diào)節(jié)γ-secretase對不同底物的活性。將結(jié)合E2012的γ-secretase與APP片段復(fù)合起來，發(fā)現(xiàn)E2012與C99的N端發(fā)生沖突（圖6, F&G），這種沖突可能使C99募集更困難或促進(jìn)C99的解旋退繞。后者可導(dǎo)致C99進(jìn)一步向下移動到PS1活性位點，并增加將Aβ切割成較短片段的可能性。先前的研究也已證明：存在E2012時Aβ40和Aβ42產(chǎn)量降低，而Aβ38產(chǎn)量升高[17]。
圖6.?人源γ-secretase結(jié)合E2012的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?(原文圖5)
- 總結(jié) -
時至今日，科學(xué)家們?yōu)榱斯タ薃D已經(jīng)積累了幾十年的努力。然而我們尚未發(fā)現(xiàn)任何一種手段可以有效緩解疾病，甚至連延緩認(rèn)知障礙的進(jìn)展都很難做到。這在很大的程度上和AD病因不完全明確、相關(guān)生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能尚未被完全闡明有關(guān)。施一公團(tuán)隊這項工作應(yīng)用Cryo-EM SPA技術(shù)，在近原子分辨率上解析了γ-secretase與多種小分子結(jié)合后形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。有關(guān)結(jié)果一方面進(jìn)一步揭示了現(xiàn)有先導(dǎo)化合物或第一代藥物分子的作用機制，另外一方面也可以啟發(fā)研發(fā)人員基于結(jié)構(gòu)對藥物分子進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，Cryo-EM SPA技術(shù)的解析分辨率已經(jīng)可以達(dá)到3?以下，有關(guān)文章在近年也呈現(xiàn)爆發(fā)式增長。今后，冷凍電鏡必將成為藥物發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化的強大助力，為守護(hù)人類健康做出更大貢獻(xiàn)。
- Sherington R., et al. Cloning of the gene bearing missense mutations in early onset familial Alzheimer disease.? (1995)
- Takami M., et al. Gamma-Secretase: successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of beta-carboxyl terminal fragment. ?(2009)
- Kidd M. Alzheimer’s Disease–an Electron Microscopical Study. (1946)
- Rogaev E.I., et al. Familial Alzheimer’s disease in kindreds with missense mutations in a gene on chromosome 1 related to the AD type 3 gene. (1995)
- Borchelt D.R., et al. Familial Alzheimer’s disease-linked presenilin 1 variants elevate Abeta1-42/1-40 ratio in vitro and in vivo. (1996)
- Golde T.E., et al. Targeting Aβ and tau in AD, an early interim report. (2010)
- Liao M., et al. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. (2013)
- An atomic structure of human γ-secretase. (2015)
- YangG., et al. Structural basis of Notch recognition by γ-secretase. (2018)
- ZhouR., et al. Recognition of the APP by human γ-secretase. (2019)
- YangG., et al. Structural basis of γ-secretase inhibition and modulation by small molecule drugs. (2021)
- Henley, D.B., et al. Development of Semagacestat (LY450139), a functional gamma-secretase inhibitor, for the treatment of Alzheimer’s disease. (2009)
- Siemers, E.R., et al. Safety, tolerability, and effects on plasma and erebrospinal fluid amyloid-beta after inhibition of gamma-secretase. (2007)
- Doody, R.S., et al. A phase 3 trial of semagacestat for treatment of AD. (2013)
- Doody, R.S., et al. Alzheimer’s Disease Cooperative Study (2015).
- Cha′ vez-Gutie′rrez, L., et al. The mechanism of γ-secretase dysfunction in familial Alz[1]heimer disease.?（2012）
- Pozdnyakov, N., et al. γ-secretase modulator (GSM) photoaffinity probes reveal distinct allosteric binding sites on presenilin.?（2013）
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