▲?圖1.基因治療技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)

▲?圖2.普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程

在1953年，生物學(xué)界出現(xiàn)了一個(gè)具有劃時(shí)代意義的發(fā)現(xiàn)：Watson（沃森）和 Crick（克里克）提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，確定A（腺嘌呤）與T（胸腺嘧啶）配對(duì)、G（鳥嘌呤）與C（胞嘧啶）配對(duì)，由此開啟了分子生物學(xué)時(shí)代。在這之后，DNA半保留復(fù)制、中心法則等相繼被提出，為基因工程的探索提供了理論依據(jù)，也奠定了基因治療中重要的一環(huán) ——“基因表達(dá)與調(diào)控”的基礎(chǔ)。

1962年，Waclaw Szybalski(瓦克勞·斯吉巴爾斯基)發(fā)表文章《DNA-mediated heritable transformation of a biochemical trait》。他通過在D98S細(xì)胞的兩種衍生物HGRPT(+)型細(xì)胞和HGRPT(-)型細(xì)胞之間進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在HAT培養(yǎng)基中篩選，發(fā)現(xiàn)將HGRPT(+)型的D98S細(xì)胞的DNA導(dǎo)入HGRPT(-)型的D98S細(xì)胞后，原本不能在HAT培養(yǎng)基中存活的HGRPT(-)型細(xì)胞可以正常存活增值了。該研究結(jié)果成為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中遺傳基因轉(zhuǎn)移的第一個(gè)有記錄的證據(jù)，證明遺傳缺陷可以通過外源的DNA來修復(fù)。為基因治療提供了進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。

▲?圖3.D98S細(xì)胞的遺傳基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

在生物學(xué)領(lǐng)域新發(fā)現(xiàn)、新事物層出不窮的背景下，Edward Tatum（愛德華·塔特姆）和Joshua Lederberg在1963年提出可利用病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體，進(jìn)行細(xì)胞的基因交換和基因優(yōu)化。

1966年，Edward Tatum在《Molecular biology, nucleic acids, and the future of medicine》中寫道：“These will come by epidemiological, immunological, and chemotherapeutic means, by modification and regulation of gene activities, orby means of?gene repair or replacement.”。預(yù)測(cè)基因修復(fù)和替代將在疾病治療中有極大的前途和作用。并且提到，在關(guān)鍵酶、基因編碼以及合適的方法確立后，基因就可以在體外有序的合成。再加上已有的DNA攝取和整合技術(shù)，基因工程的實(shí)現(xiàn)便指日可待了！

但是此時(shí)這只是科學(xué)家們暢想的美好藍(lán)圖，就連Gene Therapy這個(gè)名詞都還沒有出現(xiàn)，顯然在技術(shù)積累上還需要繼續(xù)蓄力。正如最初的電子計(jì)算機(jī)ENIAC（埃尼阿克）發(fā)展成如今的電腦，需要有更多的關(guān)鍵性新技術(shù)和新工具出現(xiàn)。

迷途中實(shí)踐-第一個(gè)吃螃蟹的人

快還是慢- Gene Therapy如何抉擇

20世紀(jì)七八十年代是基因工程飛速發(fā)展的階段，一系列與基因修飾和合成相關(guān)的酶被發(fā)現(xiàn)：包括限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶等。這些酶的發(fā)現(xiàn)促成了第一個(gè)重組DNA分子的產(chǎn)生，促成了在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)葡萄球菌乃至哺乳動(dòng)物的基因，同時(shí)也為病毒載體介導(dǎo)的基因治療技術(shù)發(fā)展帶來了信心。所有人都在熱切盼望技術(shù)成功的那一天。

“Gene Therapy for Human Genetic Disease? ”Theodore Friedmann（西奧多·弗里德曼） 1972年在 Science 上發(fā)表了一篇評(píng)論，第一次提出了基因治療的概念，同時(shí)也表達(dá)了對(duì)基因治療未來發(fā)展的憧憬和擔(dān)憂。在當(dāng)時(shí)，已知由基因缺陷導(dǎo)致的遺傳病就有1500多種，而且大部分是罕見病，他們面對(duì)的是更少的研究投入和更渺茫的治愈可能。用外源的“good”基因代替有缺陷的基因，通過基因治療的手段去治療疾病，將給這些患者帶來福音。然而，雖然基因治療的概念藍(lán)圖早已被畫出，但是病毒載體的修飾、基因表達(dá)的調(diào)控（靶向性，整合效率等）、免疫原性等問題都是不得不去思考和重視的關(guān)鍵因素。他提倡建立倫理-科學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)，來規(guī)范和約束大家的激進(jìn)嘗試：（1）清楚疾病發(fā)生原因；（2）考慮病人的異質(zhì)性，看似癥狀相同的遺傳疾病在不同的個(gè)體中具有不同的遺傳方式；（3）外源性DNA載體質(zhì)量和安全性保證；（4）在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上進(jìn)行廣泛的研究；（5）對(duì)于某些遺傳性疾病，先利用體外培養(yǎng)的患者皮膚成纖維細(xì)胞做測(cè)試?；蛑委熥罱K目標(biāo)是盡可能實(shí)現(xiàn)患者的利益，使用之前要充分評(píng)估其風(fēng)險(xiǎn)，因此病因和治療機(jī)制必須明確，不成熟地應(yīng)用不被充分理解的技術(shù)，會(huì)造成嚴(yán)重的后果。總之倫理的規(guī)范、科學(xué)的依據(jù)才是基因治療實(shí)現(xiàn)應(yīng)用的前提。

快就是慢- 一次失敗的實(shí)驗(yàn)

1979年， Martin Cline（馬丁·克萊因）利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方式，成功將人免疫球蛋白基因?qū)胄∈蟮墓撬杓?xì)胞，用于免疫球蛋白基因缺陷小鼠的治療。除此之外，他還將外源基因(二氫葉酸還原酶和單純皰疹病毒胸苷激酶)導(dǎo)入小鼠骨髓干細(xì)胞，而這些修飾過的細(xì)胞能夠在其他小鼠的骨髓中部分再生。受到這些結(jié)果的鼓舞，1980年Martin Cline打算在病人身上測(cè)試這種治療方法，他向UCLA (加州大學(xué)洛杉磯分校)申請(qǐng)使用同樣的方法治療β-地中海貧血患者。在本系列之前的文章中已經(jīng)提到過，β-地中海貧血是由于血紅蛋白中β –珠蛋白的缺失（缺陷）造成的，通常會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的甚至危及生命的貧血，當(dāng)時(shí)對(duì)此唯一的治療方案是依賴于頻繁輸血。之所以選擇地中海貧血是由于人們對(duì)它的研究較多，以為其發(fā)病機(jī)制已比較清楚（實(shí)際上地貧的病因和治療極其復(fù)雜）。然而，他的申請(qǐng)并沒有得到審查委員會(huì)的許可，但是他還是啟動(dòng)了這項(xiàng)研究！從兩名β-地中海貧血重癥患者身上抽取了骨髓細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行改造和回輸，一名患者在意大利接受治療，另一名在以色列接受治療。但是很可惜這次試驗(yàn)因?yàn)闆]有使患者的臨床癥狀得到緩解而宣告失敗，Martin Cline也因開展未經(jīng)批準(zhǔn)的人體實(shí)驗(yàn)受到了嚴(yán)厲處罰和廣泛指責(zé)。這次試驗(yàn)是第一次嘗試?yán)弥亟MDNA進(jìn)行基因治療，雖然已經(jīng)意識(shí)到對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因修飾在基因治療中的重要性，但顯然低估了其復(fù)雜性。此次事件后，體細(xì)胞基因治療一度受到冷落。

進(jìn)入春天-?監(jiān)管下的基因治療

直到1988年12月，RAC (重組DNA咨詢委員會(huì)) 正式批準(zhǔn)了Steven Rosenberg（史蒂文 ? 羅森伯格)關(guān)于將外源基因?qū)肴梭w的臨床方案。在之前的研究中，Rosenberg發(fā)現(xiàn)通過 TILs (腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞)和白介素-2可以治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，于是他從轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者身上提取了TILs，并利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體對(duì)其進(jìn)行了抗性標(biāo)記，想要探究TILs浸潤(rùn)和它們對(duì)腫瘤治療的有效性之間是否存在臨床相關(guān)性。后來再看，這次試驗(yàn)僅是用一個(gè)報(bào)告基因構(gòu)建的表達(dá)載體，了解標(biāo)記基因在人體內(nèi)的分布和表達(dá)情況，可以看作一個(gè)基因治療對(duì)照實(shí)驗(yàn)，并不是真正的基因治療。

1990年，史上最早被正式批準(zhǔn)的基因治療人體試驗(yàn)開始了。William French Anderson(威廉·弗蘭奇·安德森)醫(yī)生領(lǐng)銜開展了針對(duì)重癥聯(lián)合免疫缺陷?。⊿CID）的基因治療。SCID是由ADA（腺苷脫氨酶）缺陷或白介素受體(IL-2R最常見)功能障礙所致。ADA-SCID為常染色體隱性遺傳病，兩條染色體上的ADA基因都發(fā)生了突變，導(dǎo)致ADA蛋白缺失，從而引起細(xì)胞損傷或死亡，致細(xì)胞體液免疫缺陷，人體內(nèi)的免疫T細(xì)胞會(huì)很快死去，這相當(dāng)于身體對(duì)細(xì)菌和病毒開放，非常危險(xiǎn)。兩名ADA-SCID的患病兒童接受了此次基因治療，研究人員從患兒血液中提取了白細(xì)胞，并在體外利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將能夠正確編碼ADA的基因插入患者的白細(xì)胞基因組中，然后進(jìn)行白細(xì)胞回輸。之后的檢測(cè)表明， 其中一位受試者Ashanti DeSilva（阿莎提·德席爾瓦）體內(nèi)的白細(xì)胞確實(shí)可以正確地合成ADA了，在6個(gè)月后她的T細(xì)胞水平便恢復(fù)了正常值。盡管這種藥物顯著減輕了Ashanti的癥狀，但是并沒有完全治愈她，直到現(xiàn)在她仍需定期接受 PEG-ADA (聚乙二醇腺嘌呤脫氨酶)的替代治療，因此人們對(duì)本次基因治療的效果仍存在一些爭(zhēng)議。但無論如何這次試驗(yàn)意義重大，是一個(gè)典型的成功案例，也讓基因治療正式走進(jìn)了普通大眾的視野，基因治療在理論、技術(shù)、政策上全面的進(jìn)入了春天。

▲?圖4.?Anderson醫(yī)生和Ashanti

60年代到90年代，從提出基因優(yōu)化的概念到第一例臨床實(shí)驗(yàn)的審批，短短三十年的時(shí)間，基因治療便從理論走向現(xiàn)實(shí)；而后從1990年直到現(xiàn)在，又是三十年過去了，后續(xù)的研究應(yīng)用又是如何站在巨人的肩膀上昂首向前的？基因治療“道阻且長(zhǎng)”，但我們充滿期待與信心，且看下回再與您共同回顧！

【參考文獻(xiàn)】：